Analýza DNA

V roce 1983 objevil Kary Mullis princip řetězové polymerázové reakce (polymerase chain reaction – PCR). V roce 1985 vyšla první publikace, která metodu PCR použila. Metoda PCR umožnila množení vybraného úseku DNA in vitro bez živých organizmů. Tato novinka v molekulární biologii nejenom umožnila detekci různých polymorfizmů DNA ve vztahu ke geneticky podmíněným chorobám, ale záhy začala zasahovat také do diagnostických postupů v lékařské mikrobiologii.

Předností metody PCR byla hned od počátku její vysoká senzitivita a specifita, kdy na namnožení potřebného identifikovatelného množství DNA stačilo asi 100 templátových molekul DNA. Později byla zavedena tzv. nested PCR metoda, která nejenže až stonásobně zvýšila senzitivitu metody (až na jednu templátovou DNA), ale zavedením dalších specifických primerů také zvýšila specifitu metody. Nested PCR využívá dvou párů primerů (vnějších primerů ohraničujících větší úsek DNA a vnitřních primerů, ohraničujících menší úsek DNA) a dvou amplifikačních reakcí za sebou. K detekci amplifikované DNA většinou slouží elektroforéza a specifita PCR metody je ověřena porovnáním délky amplifikovaného fragmentu s délkovým standardem. Délka amplifikované DNA je specifická pro každou PCR metodiku.

Další vývoj nastal se zavedením metody tzv. RealTime PCR, která umožňuje sledování přibývání DNA v průběhu její amplifikace v „reálném čase“. Při metodě RealTime PCR jsou využívány dva primery a sonda se značkou, která po ozáření světlem o určité vlnové délce emituje záření o vlnové délce, která je specifická pro danou značku. Na první pohled by se zdálo, že vzhledem k tomu, že při metodice RealTime PCR jsou používány pouze dva primery jako u klasické metody PCR, může dojít ke snížení senzitivity metody, ale opak je pravdou. Při vhodném nastavení metody RealTime PCR může být senzitivita metody dokonce vyšší než u metody nested PCR. Záleží především na vhodném návrhu a nastavení metodiky, dále pak na použití vhodných chemikálií a citlivých termocyklérů pro RealTime PCR. Při metodice RealTime PCR lze sledovat nárůst množené DNA v každém dalším amplifikačním cyklu.

V lékařské mikrobiologii našla metoda PCR uplatnění záhy jako rychlá diagnostická metoda pro stanovení Mycobacterium tuberculosis. V diagnostice tuberkulózy se DNA diagnostika stala standardním vyšetřením, které vždy musí být doplněno kultivačním vyšetřením. Díky DNA diagnostice lze antituberkulotika nasadit včas a nečekat týdny na výsledky kultivačního vyšetření. Další uplatnění našla metoda PCR při diagnostice virových chorob, kde bylo dříve nutné používat kultivaci virů např. na tkáňových kulturách nebo embryích, nebo kde jedinou metodou detekce bylo sérologické vyšetření. PCR metoda nejen zcela vytlačila z virologických laboratoří kultivační vyšetření, ale také několikanásobně zvýšila citlivost laboratorní diagnostiky. V posledních letech je metoda RealTime PCR využívána například pro kvantifikaci virů hepatitidy C nebo HIV v souvislosti s léčbou, kdy pravidelný skríning koncentrace virů v séru odráží úspěšnost léčby.

Objev řetězové polymerázové reakce (PCR) předznamenal prudký vývoj molekulární biologie a umožnil její praktické aplikace do klinické praxe. Současnou diagnostiku mnohých infekčních chorob a geneticky podmíněných chorob si již nelze bez PCR analýzy představit. Přitom od objevu PCR uběhlo teprve necelých 25 let. Za tuto dobu byla díky metodě PCR provedena obrovská spousta velkých asociačních studií civilizačních chorob jakými jsou srdečně-cévní choroby (infarkt myokardu, hypertenze, mozková mrtvice, cévní trombóza), cukrovka, obezita nebo třeba rakovina prsu a prostaty. Byly nalezeny stovky mutací a polymorfizmů, které ovlivňují patogenezi těchto onemocnění.

V posledních letech se objevily další nové postupy analýzy DNA. Jedná se o takzvané microarray – DNA čipy. V současné době exitují dvě společnosti, které lze nazvat lídry v oblasti DNA čipů. Jedná se o americké společnosti Affymetrix a Illumina. Společnost Illumina používá speciální destičky, na jejichž povrchu jsou umístěny miniaturní kuličky. Každá kulička na svém povrchu nese speciální sekvenci, která je specifická pro analýzu jednoho polymorfizmu. Celý proces detekce polymorfizmů pak lze popsat následovně. Při genotypizační metodě GoldenGate jsou využívány tři oligonukleotidy (krátké sekvence DNA). Dva z nich jsou alelicky specifické (rozpoznávají na DNA jednotlivé varianty polymorfizmů), každý z nich nese odlišnou fluorescenční značku (značka, která vydává po ozáření světlo o určité vlnové délce) a jsou komplemetární k sekvenci vyskytující se před analyzovaným polymorfizmem, kdy polymorfizmus je umístěn na 3´ konci oligonukleotidu. Třetí oligonukleotid je specifický k sekvenci vyskytující se za analyzovaným polymorfizmem (lokusově specifický oligonukleotid - LSO). Tento LSO nese navíc sekvenci, která specificky hybridizuje k sekvenci navázané na kuličce. Při vlastní metodě na analyzovanou sekvenci DNA hybridizují alelicky specifické oligonukleotidy a LSO. Následně se amplifikuje pouze ten produkt, který obsahuje alelicky specifický oligonukleotid, který ke je na 3´konci komplementární ke genotypizovanému polymorfizmu. Namnožená DNA poté hybridizuje na základě specifické sekvence v rámci LSO k dané kuličce. Každý produkt přitom nese specifickou fluorescenční barvu, vázanou na alelicky specifickém oligonukleotidu. Vzhledem k tomu, že každá kulička je specifická (nese specifickou sekvenci k analyzovanému lokusu) a při hybridizaci k ní hybridizuje amplifikovaná sekvence se specifickou barvou, tak po ozáření světlem o specifické vlnové délce je možno z emitované fluorescence a pozice kuličky na čipu určit daný polymorfizmus. Pro každou alelu se využívá jiná barva, takže pokud kulička září jednou barvou, jedná se o homozygota, pokud oběma barvami, jedná se o heterozygota.

Společnost Affymetrix využívá pro genotypizaci technologii GeneChip®Arrays. GeneChip microarray se skládá z malých DNA fragmentů (nazývaných próbami), které jsou pomocí speciální chemie syntetizovány na specifickém místě (značce) na povrchu čipu potaženém křemíkem. Takovýchto specifických značek mohou být na jedné GeneChip Array milióny. Pro každý polymorfizmus jsou pomocí této technologie nasyntetizovány dvě próby, kdy každá z nich nese přibližně uprostřed sekvence příslušnou variantu polymorfizmu. Při vlastní genotypizační analýze je vyizolována genomová DNA, ta je následně namnožena a naznačena pomocí specifické fluorescenční značky. Takto připravená genomová DNA je následně hybridizována na GeneChip Array, kdy k jednotlivým próbám na čipu hybridizují pouze 100% komplementární sekvence na DNA. Po provedené hybridizaci je čip oskenován pomocí speciálního fluorescenčního skeneru, kdy jsou zaznamenány pouze ty pozice na čipu, ve kterých došlo k úspěšné hybridizaci mezi próbou a fluorescenčně značenou genomovou DNA. Takto oskenovný čip je poté vyhodnocen softwarem, který přiřadí k jednotkivým pozicím na čipu příslušné sekvence prób a tím i příslušnou variantu polymorfizmu vyskytující se v genomové DNA.